用甲醛固定后,染色部分保留。 LumiTracker ER Green 和 LumiTracker ER Red 不適合對(duì)固定后的細(xì)胞進(jìn)行染色。
注意:格列本脲的藥理活性可能會(huì)影響 ER 功能。某些特殊細(xì)胞類型中磺脲類受體的可變表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致非 ER 標(biāo)記。
將 50 μg LumiTracker ER Green 溶解在 64 μL DMSO 中,以獲得 1 mM 儲(chǔ)備溶液。
將 50 μg LumiTracker ER Red 溶解在 55 μL DMSO 中,以獲得 1 mM 儲(chǔ)備溶液。
注意:我們建議將儲(chǔ)備溶液儲(chǔ)存在?20°C或?80°C避光條件下。避免反復(fù)凍融循環(huán)。
用鈣和鎂 (HBSS/Ca/Mg) 在 Hank's 平衡鹽溶液中稀釋 LumiTracker ER 染色劑的儲(chǔ)備溶液,以獲得工作溶液。使用 100 nM 至 1 μM 的濃度。 LumiTracker ER 染色劑的稀釋度取決于細(xì)胞類型和密度,應(yīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定。
1000 g離心細(xì)胞懸液 3-5 分鐘;棄去上清液。
用預(yù)熱的 HBSS 在 37°C 下清洗細(xì)胞兩次,每次 5 分鐘。
推薦的細(xì)胞密度為1×10 6 個(gè)細(xì)胞/mL。
將 1 mL 預(yù)熱的 LumiTracker ER 工作溶液添加到管中,并在 37 °C 和 5% CO 2下孵育細(xì)胞 15-30 分鐘。
室溫下以 400 g離心細(xì)胞 3-4 分鐘;棄去上清液。
用培養(yǎng)基清洗染色細(xì)胞兩次。
用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基或 PBS 重懸細(xì)胞。
通過(guò)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。
對(duì)于熒光顯微鏡,將一滴染色的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到載玻片上。用蓋玻片蓋住細(xì)胞。
在無(wú)菌蓋玻片上培養(yǎng)細(xì)胞。
貼壁細(xì)胞可以直接在蓋玻片上染色。
從蓋玻片中吸出介質(zhì)。
用 37°C 預(yù)熱的 HBSS 沖洗細(xì)胞。
加入 100 μL 預(yù)熱的 LumiTracker ER 工作溶液,輕輕搖動(dòng)以全覆蓋細(xì)胞。在 37 °C 和 5% CO 2下孵育細(xì)胞 15-30 分鐘。
用培養(yǎng)基清洗染色細(xì)胞兩次。
如果通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),則需要在染色前重懸細(xì)胞。
對(duì)于熒光顯微鏡,將帶有染色細(xì)胞的蓋玻片翻轉(zhuǎn)到載玻片上,將它們放置在載玻片和蓋玻片之間。
如果要固定染色的細(xì)胞,請(qǐng)?jiān)?4% 甲醛中于 4 °C 下孵育 2 分鐘。
固定細(xì)胞用 PBS 清洗兩次,每次 5 分鐘。
使用封固劑將細(xì)胞封固在蓋玻片下 。